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        雙靶點CRISPR載體構建 (哺乳動物細胞)q1822235623

        點擊次數:1241  發布時間:2019/7/1 11:29:01

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        公司名稱:上海海吉浩格生物科技有限公司 型 號: 生產地址:中國大陸 已獲點擊:1241 簡單介紹: 雙靶點CRISPR載體構建 (哺乳動物細胞)
        慢病毒,腺病毒,腺相關病毒,逆轉錄病毒質粒
        核表達質粒
        原核表達質粒
        報告基因質粒
        自噬質粒
        雙分子熒光
        抗體表達質粒
        基因輯質粒,
        酵母相關質粒
        植物相關質粒,
        昆蟲相關質粒
        shRNA質粒
        枯草芽孢桿菌質粒

        詳細內容

        雙靶點CRISPR載體構建 (哺乳動物細胞)

        上海海吉浩格生物科技有限公司


        1. CRISPR/Cas9核酸酶切靶序列原理圖

         



        2 相關載體圖譜

        2.1中間載體 ,sgRNA載體(預設有BbsI酶切位點)

        中間載體


        2.2 CRISPR/Cas9骨架載體,表達CAS9,同時有完整的sgRNA表達框

         

         

        含有CAS9的骨架載體

        (骨架載體可以換成PX459、PX461,PX462、lenticrispr V2、lentiguide-puro或者其他同種gRNA scaffold的質粒)

          

        3. 基因組靶位點選擇和雙鏈接頭設計

        3.1 靶位點選擇

        根據目的基因的物種在sgRNA設計網站上是設計靶點序列,根據需要選擇特異性好的兩個sgRNA靶點序列。

        注(20nt靶點中FR是為了標記序列方向的堿基,F--R為正向,R--F為反向互補;NM都代表任意堿基,本文N20代表sgRNA1,M20代表sgRNA2

         

        對個目的基因設計2個靶點。建議在ORF 5’區和功能結構域各設計1個靶點,使之任何1個靶點的突變都可以產生功能缺失,或2個靶點之間的序列被敲除。


        3.2引物設計

        PCR產物核心公共序列

        gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttCTAGCAAAATAGGCTGTCCCCGCGGGGCATGACTATCGTCgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccG


        PCR擴增后的序列

        GaagacaccaccG-FNNNNNNNNNNNNNNNNNNR-gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttCTAGCAAAATAGGCTGTCCCCGCGGGGCATGACTATCGTCgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccG-FMMMMMMMMMMMMMMMMMMR-gtttaggtcttc

         

         

        引物共用序列

        F: GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAA

        R: CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC

         

        設計完成的序列

        sgRNA1-F(PX458):

        5-gaagacaccaccGFNNNNNNNNNNNNNNNNNNRGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3

        sgRNA2-R:

        5- gaagacctaaacRMMMMMMMMMMMMMMMMMMFCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC -3

         

        1:這對引物是以PX458/PX459為骨架載體,選擇BbsI酶切位點(lentiguidelenticrispr v2建議設計為BsmBI),同時正向引物需要加長;

        2:這種方法設計引物比較長,引物合成和后續PCR會有困難,也可以每條sgRNA設計兩個短的引物進行巢式PCR。

         


        3.3 PCR擴增序列

        根據設計的兩個靶點的引物,擴增插入序列

        pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep為模板擴增得到如下目的序列


        4 中間gRNA表達盒與表達CAS9骨架載體連接

        本載體系統可采用2種策略進行Cas9載體和多個gRNA表達盒片段的次連接組裝: 

        策略I:Golden Gate cloning (ligation)方法 (Engler et al., 2008; 2009);

        策略II:是傳統的酶切回收保存,酶切后的載體可以多次使用,片段單獨酶切回收的方法。注:策略II載體單獨回收保存,設計中間gRNA表達盒擴增引物時,可以自由選擇實驗室比較適宜的IIS限制性內切酶,不定需要和載體同樣的酶。


        5 測序檢測

        構建成功之后的雙sgRNA表達框如下

        兩個表達框中間設計有測序引物RVP3可以測序sgRNA2表達框,測序引物RVP4可以測序sgRNA1表達框。因兩個表達框序列相識度比較高、結構復雜,可能會導致測序結果不好。如果骨架載體常用建議在骨架載體上重新選擇引物測序,選距離兩側大于200bp遠的位置設計測序引物。


        附件

        中間載體pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep介紹

        1,pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep中插入的sgRNA表達框不是正常的結構,而是倒置的結構,不能單獨使用,需要配合原有的sgRNA表達框(插入hU6- -gRNA scaffold之間)使用,才能形成(hU6- gRNA scaffold-hU6- gRNA scaffold)雙表達框結構。

        插入序列結構 BbsI-gRNA scaffold-測序引物-hU6啟動子-BbsI

        紅色G是根據addgene部分構建好的質粒經驗,在sgRNA20個堿基之,建議保留sgRNA插入紅色GgRNA scaffold之間。

        插入序列中引入引物RVP3RVP4作為測序引物,是熒光素酶報告基因質粒的常用引物,為防止和Cas9骨架質粒引物重復導致無法測序。為了壓縮質粒大。省錢),兩個表達框之間沒有插入太多堿基,盡管插入兩個比較常用引物序列,結構復雜也有可能導致測序套峰或者中斷的可能。如果測序不好建議在骨架質粒上設計引物測序

        載體中sgRNA表達框兩側都加了BbsI酶切位點,在以pX458/pX459等酶切位點為BbsI為酶切位點的Cas9骨架載體時候,引物可以相對小些。

        5-gaagacaccaccGFNNNNNNNNNNNNNNNNNNRGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3


         

        2,為了不浪費的原則,我們構建載體的時候將這個sgRNA-U6的表達框插入到個哺乳動物過表達載體中,切掉sgRNA-U6表達框就是個完整的帶有Twin-Strep-tag (Schmidt et al., 2013)的超小過表達空載體。sgRNA表達框兩側設計有兩個XhoI酶切位點,用XhoI酶切之后回收自連即可。

        雙靶點CRISPR載體構建 (哺乳動物細胞)
        雙靶點CRISPR載體構建 (哺乳動物細胞)
        雙靶點CRISPR載體構建 (哺乳動物細胞)

         

         

         

        更新時間:2022/5/16 21:23:29


        標簽:基因編輯   質粒   CRISPR   cas9   質粒寶   

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